إنتاج نباتات كوسة معدلة وراثيا

ومقاومة لفيروس تبرقش  الزوكيني  الأصفر

 

سعيد محمد خليل*    عاطف شكري صادق السيد**    حمدي حسن علي الضويني***

   مجدي أحمد مدكور*1-

 

الملخص :

يعتبر فيروس تبرقش الزوكيني الأصفر (ZYMV) من اخطر الفيروسات التي تصيب القرعيات وخاصة الكوسة في مصر. ولانتاج نباتات كوسة اسكنداراني معدلة وراثيا ومقاومة لهذا الفيروس فقد تم استخدام تقنية زراعة الأنسجة باستخدام بادئات نباتية مأخوذة من قمم بادراتShoot tip explants  نبات الكوسة لتكوين كالوسات قادرة علي التمايز من خلال تنميتها علي بيئة S3. وقد تم إجراء التحول الوراثي Genetic Transformation  باستخدام بكتريا الاجروباكتريم تيوميفاشينز A. tumefaciens السلالة  LBA4404 والحاملة للبلازميد pGA643 المحمل بجين الغلاف البروتينيCoat protein gene  للسلالة الأمريكية من الفيروس ZYMV المعروفة باسم Connecticut، وأيضا جين مقاومة  المضاد الحيوي الكاناميسين npt II  كجين واسم (Marker gene)  . هذا وقد أمكن الحصول علي 22 نباتا (سلالة)   Ro-Lines مقاومة للكاناميسين. وقد تم تقييم هذة السلالات باستخدام تكنيك تفاعل تسلسل البلمرة PCR وكذلك تكنيك تهجين الـDNA  (Southern blot)  الموسوم بالفوسفور المشع 32P للكشف عن احتواء هذه السلالات المحولة وراثيا لجين الغلاف البروتيني للفيروس من السلالة الأمريكية (ZYMV-CT-cp). وقد تم تقدير مقاومتها للفيروس وذلك بعد 2، 4، 6 أسابيع من الحقن الميكانيكي مرتين بالعزلة المصرية تحت ظروف الـ Biocontainment  وذلك باختبار الإليزا ELISA و أيضا الكشف عن الأعراض المميزة لفيروس ZYMV وقد ثبت أن 6 من الـ15 نباتLines)  تتحمل الإصابة بالـ ZYMV بعد 6 أسابيع من الحقن بالفيروس، بينما كانت النباتات غير المعدلة وراثيا والمستخدمة للمقارنة تتحطم كاملا بعد 3 أسابيع من الحقن. وقد أظهرت ثلاثة نباتات (خطوط 5، 6، 17) قدرة عالية علي تحمل الإصابة حيث أن أعراضا خفيفة قد ظهرت بعد 10 أسابيع من الحقن بالفيروس. وبالنسبة للنباتات في الـ  R1 (خطوط 5،6،11،17،22) وفي الـR2  (أربع عائلات من كل من خطي 5 ، 17) وفي الـ  R3 (أربع عائلات من تحت العائلة من كل من خطي 5 ،17) . وقد تم تقدير مقاومتها للإصابة الفيروسية تحت ظروف الصوبه كما ذكر من قبل. وقد ثبت أن العائلة H  من خط 17 كانت أكثر العائلات مقاومة حيث أن ظهور الأعراض الخفيفة كان بعد الأسبوع العاشر بالفيروس.

المقدمة :

إن الفيروسات النباتية يمكنها أن تسبب في خسارة فادحة لكثير من المحاصيل الزراعية وذلك بخفض الإنتاج أو الجودة لمثل هذه المحاصيل. وقد ثبت أن استخدام الطرق التقليدية في مقاومة الأمراض الفيروسية مثل الكشف الدوري علي النباتات وإزالة المصاب منها واستخدام المبيدات الحشرية لمقاومة الناقل الحشري لم تعد بالدرجة الكافية.  وقد ثبت أن الخطوة المستقبلية الهامة لمقاومة مثل هذه الفيروسات هي إنتاج نباتات معدلة وراثيا باستخدام تقنية الهندسة الوراثية بإدخال جين الغلاف البروتيني الفيروسي (Namba et al., 1992 and Clough and Hamm, 1995) . وتمثل إستراتيجية استخدام الغلاف البروتيني نقطة هامة نحو إمكانية المقاومة الفيروسية في النباتات (Gonsalves and Slightom, 1993 and Lomonscoff, 1995).

وقد تم تقسيم فيروس التبرقش الزوكيني الأصفر كأحد أفراد مجموعة البوتي فيروس (ZYMV)  ويتبع جنس البوتي فيروس في عائلة البوتيفيريدي، ويحتوي علي جينوم مكون من حمض النواة الـ RNA وحيد السلسلة. هذا بالإضافة إلى وجود أربعة سلالات هي الـ C، FL ، WK ،   TW تم دراستها ومقارنتها (Wang et al., 1992). كما أوضحوا أن الفيروس مرتبط سيرولوجيا بعدة فيروسات هي: فيروس موزيك البطيخ 2 وفيروس موزيك البسلة وفيروس الموزيك الشائع في الفول وفيروس اصفرار العروق في البرسيم وفيروس الموزيك الأصفر في الفول. كما ثبت أن نوعين من حشرة المن هما حشرة من الخوخ وحشرة من الفول ليس لهم القدرة علي السلالة الفرنسية WK  بينما تنقل الثلاثة سلالات الأخرى بنجاح. وعلي المستوي الجزيئي فإن جين الغلاف البروتيني يقع في الطرف 3¢ من الإطار المفتوح للقراءة(ORF)  ويعبر عن البروتين الفيروسي (Shukla et al., 1994).

وفي مصر فإن الكوسة (Cucurbita pepo L.)  والتي تزرع في مساحة تقرب من 78217 فدان وتنتج حوالي 568000 طن. وقد أوضح العالم Provvidenti et al., (1984)  وآخرون أن هذا الفيروس  ZYMV كان أخطر الفيروسات التي تصيب الكوسة و الشمام وقرعيات أخري.

وقد أوضح العالم  Sherf and MacNab (1986) أن مقاومة مثل هذا الفيروس بالطرق التقليدية غير كاف ولكن نجاح ملموس قد يحدث عند استخدام الزيوت المعدنية في رش النباتات وقد أكد هذا العالم Webb and Linda (1993) . كما أن انتاج نباتات معدلة وراثيا مقاومة للفيروس فد  اتضح أنها الإستراتيجية الفعالة لمقاومة الفيروسات النباتية (PowellAbel et al., 1986; Yoshioka et al., 1993 and Carr et al., 1994) ، وفي عام 1996 استطاع أبوصالحه وآخرون إنتاج نباتات كوسة بها جين الغلاف البروتيني للفيروس باستخدام البلازميد pCIB10.

ويهدف هذا العمل الي استخدام تقنية الهندسة الوراثية لعمل نظام لانتاج نباتات كوسة معدلة وراثيا وتحتوي علي جين الـ ZYMV-CT-cp في الصنف اسكنداراني ، و تقييم النباتات المتحصل عليها في عدة أجيال هي Ro-R1-R2-R3.

 

المواد والطرق :

مصدر بذور الكوسة :

تم الحصول علي بذور الكوسة صنف اسكنداراني من معهد بحوث البساتين التابع لمركز البحوث الزراعية-الجيزة-مصر.

 

التحول الوراثي وإعادة التمايز:

بناء علي طريقة أبوصالحة وآخرون عام 1996 تم تنفيذ نظام التحول الوراثي باستخدام:

أ- القمة النامية كجزء نباتي.

ب- استخدام بكتريا الأجروباكتريم سلالة LBA4404.

ج- بلازميد PGA643 الحامل لجين الغلاف البروتيني للعزلة CT وجين npt II كجين واسم.

 

استخلاص الـ DNA الجينومي:

          تم استخلاص الـ DNA الجينومي من الـ Ro & R1 لنباتات الكوسة المعدلة وراثيا طبقا لطريقة صادق (1994) . كما تم كذلك لنباتات كوسة غير معدلة وراثيا كمقارنة.

 

الكشف باستخدام تفاعل البلمرة الأنزيمي المتسلسل (PCR):

 

          تم الكشف عن وجود جين الغلاف البروتيني لفيروس الـ ZYMV-CT  باستخدام الـ PCR وذلك باستخدام زوج من البادئات هما P2(+): 5’GAT CAT TTG CTG GAA TAT AA 3’ و M2(-):5’ CTG CAT CTG AAA AAT GAT GC 3’ واللذين تم تخليقهما في معهد بحوث الهندسة الوراثية (ageri) وقد اتبع ظروف التفاعل طبقا لطريقة صادق واخرون عام 1997 مع بعض التعديلات مثل استخدام 1 ميكروليتر من تخفيف 10-1 من الحامض النووي المستخلص من النباتات كمصيغ وبرنامج 4 ق علي درجة 94 درجة مئوية لدورة واحدة و35 دورة كل منها 94 درجة مئوية لمدة 1 ق و55 درجة مئوية لمدة ق و72 درجة مئوية لمدة 2ق ثم دورة واحدة علي 72 درجة مئوية لمدة 5 ق. وقد تم الكشف عن الـ DNA الناتج بعمل اليكتروفوريسيس في 1% اجاروز جل في محلول منظم  tbe  تبع ذلك الصبغ بالأيثيديم بروميد والفحص بالـ uv.

 

التهجين بالواسم المشع وطريقة الـتهجين الجنوبي Southern blot:

            تم استخدام هذا التكنيك طبقا للطريقة التي وصفها صادق عام   1994 وذلك للكشف عن الجين موضع الدراسة ضمن جينوم نباتات الكوسة المتحصل عليها في الجيلين سالفي الذكر وذلك بعد نقل الـ DNA بعد الأليكتروفوريسيس الي غشاء من النوع الـ H  ybond-N . وقد تم تهجين الغشاء مع واسم متخصص للـ   cDNA لجين الغلاف البروتيني للعزلة ZYMV-CT في البلازميد pGA643  والمعلم بالفوسفور المشع كما وصف Harding et al., (1991). وبعد لف الغشاء بورق نيلون تم تعريضة لفيلم X-ray .

 

الكشف بالإليزا:

          في هذه الدراسة تم الكشف عن تعبير جين الغلاف البروتيني في نباتات الكوسة الـ Ro  المقاومة للكاناميسين بواسطة تكنيك الـ DAS-ELISA كما وصفها  Clark and Adams (1977) & Othman et al., (1996)  باستخدام وحدة الإليزا الخاصة بالـZYMV  العزلة المصرية والمنتجة بالـ AGERI .

 

تقييم المقاومة الفيروسية:

تم تقييم المقاومة الفيروسية لنباتات الـ Ro النامية تحت ظروف الـ Biocontainment   وكذلك نباتات الكوسة المعدلة وراثيا في الـ   R1, R2, R3و(3 مكرارات لكل  (Line تحت ظروف الصوب البلاستيكية والتي تم حقنها ميكانيكيا مرتين بالعزلة المصرية من الفيروس ثم متابعة ظهور الأعراض والكشف عن الفيروس بالإليزا (كما سبق بعالية)  بعد 2 و 4 و 6 أسابيع من الحقنة الثانية.

 

التلقيح:

          لقد خضعت النباتات في الـ Ro  (المتحملة للكاناميسين) والنامية تحت ظروف الـ Biocontainment للتلقيح الذاتي (Self pollination)  وتم اعتبار البذور الناتجة كـ R1 . وتم زراعة البذور في الأجيال R1, R2, R3  تحت  ظروف الصوب البلاستيكية و خضعت للتهجين الذاتي للتأكد من انتقال الجينات الي الـ Progeny  ومقاومتها للفيروس.

النتائج والمناقشة:

لقد ثبت ان فيروس التبرقش الزوكيني الأصفر(ZYMV)  انه يحدث تأثير شديد علي نباتات الكوسة حيث يسبب تشوه شديد للأوراق وتشوه للثمار، تقزم للنبات كما في الشكل رقم (1). وقد أوضح نفس الملاحظات العالمZ itter et al., (1996)  هذا الي جانب ما ذكره العالم عبد الغفار واخرون عام 1998 من أن السلالة المصرية من هذا الفيروس هي أخطر السلالات تحت ظروف الحقل المفتوح.

 

التحول الوراثي وإعادة التمايز:

          لقد أوضح العالم Manger (1993) أن إنتاج خطوط كوسة مقاومة لفيروس او عديد من الفيروسات لم يسبق وأن حدث وذلك لصعوبة النقل الجيني والاختيار بطرق التربية التقليدية. كما ذكر أن موقع الجينات المعنية بالمقاومة وارتباطها يجعل ذلك من الصعب تنفيذه بالنسبة للمربي وإنتاج نباتات مقاومة.

في هذه الدراسة تم وبنجاح إدخال جين الغلاف البروتيني للعزلة  CT من فيروس الـ  ZYMV  في الصنف اسكنداراني من نبات الكوسة باستخدام القمة النامية وبكتريا الأجروباكتريم تيوميفيشنز السلالة LBA4404  الحاملة للبلازميد pGA643 . وقد شملت منطقة النقل من الـ DNA في البلازميد علي محفز الـ 35S من فيروس موزيك القرنبيط (CaMV)  والترميناتور  (NOS)  من فيروس اتش الدخان (TEV)، هذا الي جانب جين الغلاف البروتيني للفيروس موضع الدراسة، والجين المسئول عن مقاومة الكاناميسن الـ npt II  كما هو موضح في الشكل رقم (2). النتائج في هذه الدراسة أوضحت أن 68% من الأجزاء النباتية أنتجت ساق نباتي (Shoots)  بعد أربعة أسابيع من النقل علي بيئة الاختيار ولكن 50% من هذة السيقان لم تكن قادرة علي انتاج جذور. وقد أوضح العلماء Fang and Grumet (1990) أنه قد يحدث هروب أثناء الانتخاب علي البيئة المحتوية علي الكاناميسين حيث أن بعض السيقان في الشمام (30%) و بنسية 75-90% كما ذكر العالم Dong et al., (1991)  . وقد تم بنجاح أقلمة النباتات في الـRo  وكانت سليمة وذو شكل مورفولوجي طبيعي في ثمارها. هذه النتائج تتفق مع ما ذكره أبوصالحة عام 1996. وقد اتضح أن 22 من الـ30 خط المتحصل عليهم في الـRo  من نباتات الكوسة تم أقلمتها بنجاح كما في الشكل رقم (3) تحت ظروف متحكم (Biocontainment)  فيها في الـ AGERI.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 




الكشف عن وجود وتعبير الجين موضع الدراسة :

وقد استخدم تفاعل الـ   PCR لتأكيد وجود الجين موضع الدراسة في هذة الخطوط. كما أوضحت نتائج الإليزا في الجدول رقم (1) أن تعبير جين الغلاف البروتيني موضع الدراسة قد ثبت في 15 خط من الـ 22 خط في الـ  Ro المتحصل عليها. أو بمعني آخر فان الجين كان مثبط في 7 خطوط. كما لوحظ أيضا ان  قيم الإليزا عند طول موجي 405 نانوميتر كانت تتراوح من 0.487الي 0.586. وقد أوضح ذلك أن تعبير الجين في هذه النباتات قد أعطي قيم اليزا اكبر من الغير معدلة وراثيا (0.243) بينما الغير معدلة وراثيا والمصابة بالفيروس (العزلة المصرية) قد أعطت قيمة أعلي (1.115).

 

تقييم المقاومة الفيروسية لنباتات الـ Ro  المعدلة وراثيا:

          بعد حقن الـ 15 خط الذين ثبت فيهم وجود وتعبير الجين موضع الدراسة بالعزلة المصرية من الفيروس وهي نامية تحت ظروف الـ Biocontainment . وقد أوضحت النتائج في الجدول رقم (2) أن الخطوط 5، 6 ، 17 كانت اكثر الخطوط مقاومة حيث ظهرت أعراض خفيفة بعد 6 أسابيع من الحقن الميكانيكي بالفيروس. بينما الخطوط 2، 9، 11، 13 ،22 أظهرت مقاومة متوسطة لظهور أعراض خفيفة بعد 4 أسابيع من الحقن. أما باقي الخطوط فقد كانت غير مقاومة مثل تلك غير المعدلة وراثيا وذلك لظهور أعراض شديدة بعد 2-3 أسابيع من الحقن كما في الشكل رقم (4). وقد خضعت الخطوط الثمانية للتهجين الذاتي للحصول علي بذور الجيل الأول. ولم نحصل علي بذور من الخطوط رقمي 2 ، 13.

 

تقييم نباتات الجيل الأول R1  :

في هذه التجربة تم زراعة 20، 32، 32، 44، 40، 44 بذرة من الخطوط 5، 6، 9، 11،17، 22 علي التوالي في 3 مكررات لكل خط تحت ظروف الصوب البلاستيكية. ثم خضعت هذة النباتات للحقن الميكانيكي بالعزلة المصرية من فيروس الـZYMV-Eg  وتركت بدون مقاومة للحشرات بمعني عدم استخدام اية مبيدات حشرية ثم تقييم المقاومة الفيروسية كما سبق. وقد استخدم عدد 44 بذرة غير معدلة وراثيا كمقارنة. وقد أوضحت النتائج في الجدول رقم (3) والشكل رقم (5) أن خط 5 أحسن الخطوط مقاومة يليه خطوط 17، 6، 9، 11 ثم 22 حيث أظهروا نسب مقاومة 50، 37.5، 32، 32، 27 & 25 % علي التوالي. وذلك بعدم ظهور الأعراض بعد 4 أسابيع من الحقن بالفيروس. أما باقي البذور غير المعدلة وراثيا قد أظهرت أعراض شديدة بعد 2-3 أسابيع. وقد ثبت أن خطي 5 & 17 أكثر الخطوط مقاومة حيث تأخر ظهور أعراض بهما حتى الأسبوع العاشر من الحقن. كما تم استخلاص الحامض النووي الـDNA  من 9 & 8 نباتات تابعة لخطي  5 &  17علي التوالي للكشف عن الجين باستخدام الـ PCR  وقد أوضحت النتائج في الشكل رقم (6) أن 4 & 3 نباتات قد أعطوا نتيجة موجبة مما يؤكد وجود الجين في نباتات الجيل الأول. كما ظهر انعزال وراثي حيث كان 5 من 9 نباتات و5 من 8 نباتات من خطي 5 & 17 علي التوالي سالبة، بمعني لم نحصل علي أية منتج. بالإضافة الي ذلك في اختبار التهجين الجنوبي للنباتات السبعة الذين أعطوا نتيجة موجبة في الـ  PCR فقد تم التأكد من وجود الجين حيث أعطت هذه النباتات نتيجة موجبة. وبعد إجراء تلقيح ذاتي فقد تم الحصول علي عدد من الثمار من الخطوط 5، 6، 9، 11،17، 22. وقد تم اختيار بعض الثمار واعتبرت عائلات A, B, C, D (line 5) & E, G , H (line 17) هي مصدر بذور الجيل الثاني.

 

 

 

 

جدول رقم (1) : الكشف بالإليزا عن تعبير جين الغلاف البروتيني للعزلة الفيروسية الـZYMV-CT  في خطوط الجيل الأول من نباتات الكوسة المعدلة وراثيا (Ro)

 

التعبير

النتائج

قيمة الإليزا

الخط

N

-

0.470

1

E

+

0.487

2

N

-

0.400

3

E

+

0.492

4

E

+

0.586

5

E

+

0.527

6

N

-

0.344

7

N

-

0.399

8

E

+

0.500

9

E

+

0.493

10

E

+

0.495

11

N

-

0.375

12

E

+

0.487

13

E

+

0.486

14

N

-

0.287

15

E

+

0.500

16

E

+

0.540

17

E

+

0.486

18

N

-

0.409

19

E

+

0.488

20

E

+

0.489

21

E

+

0.501

22

 

 

0.132

البلانك

 

 

0.243

السليم

 

+

1.115

المصاب بالعزلة المصرية ZYMV-Eg

N : لا يوجد تعبير.                  E : يوجد تعبير. -: سالب.                  +: موجب.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول رقم (2): تقببم الفيروس لنباتات الكوسة المعدلة وراثيا (Ro) والمحتوية علي جين الغلاف البروتيني للعزلة الفيروسية الـ ZYMV-CT  بعد 2، 4 & 6 أسابيع من الحقن مرتين بالعزلة المصرية بناء علي الأليزا والأعراض.

 

 

الخطوط

الأسابيع بعد الحقن بالفيروس

2

4

6

الأليزا

الأعراض

الأليزا

الأعراض

الأليزا

الأعراض

2

+

-

+

أخ

+

أش

4

+

أخ

+

أش

+

أش

5

+

-

+

-

+

أخ

6

+

-

+

-

+

أخ

9

+

-

+

أخ

+

أش

10

+

أخ

+

أش

+

أش

11

+

-

+

أخ

+

أش

13

+

-

+

أخ

+

أش

14

+

أخ

+

أش

+

أش

16

+

أخ

+

أش

+

أش

17

+

-

+

-

+

أخ

18

+

أخ

+

أش

+

أش

20

+

أخ

+

أش

+

أش

21

+

أخ

+

أش

+

أش

22

+

-

+

أخ

+

أش

مقارنة

+

م&ت

+

أش

+

أش

+: موجب الأليزا.            -: لا توجد أعراض.         أخ: أعراض خفيفة.           أش: أعراض شديدة.        

م: موزيك.                  ت: تحزم العروق.

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


جدول رقم (3): تقببم الفيروس لنباتات الكوسة المعدلة وراثيا (R1) والمحتوية علي جين الغلاف البروتيني للعزلة الفيروسية الـ ZYMV-CT  بعد 2، 4 & 6 أسابيع من الحقن مرتين بالعزلة المصرية بناء علي الأليزا والأعراض.

 

 

الخطوط المعدلة وراثيا

الأسابيع بعد الحقن بالفيروس

2

4

6

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

5

25*

75

50

50

80

20

6

28

72

68

32

87.5

12.5

9

37

63

68

32

87.5

12.5

11

64

36

73

27

91

9

17

50

50

62.5

37.5

80

20

22

55

45

75

25

93

7

مقارنة

86

14

100

0

100

0

+: موجب.        -: سالب.                   س: أعراض.                أ: أليزا.            *: % النباتات.

 


تقييم نباتات الجيل الأول R2 :

          تم اختيار عدد من بذور العائلات المختارة والتي أظهرت مقاومة حتى الأسبوع الثامن أو العاشر من الحقن بالفيروس وزراعتها كما سبق تحت ظروف الصوب البلاستيكية . وقد أوضحت النتائج في الجدول رقم (4) ان العائلات A, D &H كانوا ذو مقاومة عالية ضد العزلة المصرية من الفيروس حيث أن نسبة 77.8% منهم لم تظهر عليها أعراض حتى الأسبوع السادس من الحقن كما موضح في الشكل رقم (8). والأكثر من ذلك أن 74% من النباتات غير المعدلة وراثيا قد أعطت أعراض الفيروس المميزة له بعد أسبوعين من الحقن. وقد كان خط 5 اكثر مقاومة من خط 17. وقد أظل نباتين من العائلة  H  بدون أعراض حتى الأسبوع العاشر من الحقن. كما تم الحصول علي 9 ثمار تابعين للعائلات A(2), B(1), D(1), E(1), F(1) & H(3) كمصدر لبذور الجيل الثالث.

 

تقييم نباتات الجيل الأول R3 :

          تم زراعة ثلاثة مكررات من بذور العائلات المختارة من الجيل الثاني تحت ظروف الصوب البلاستيكية وقد أظهرت النتائج في الجدول رقم (5) أن العائلات H1, H2 & H3 كانت مقاومة بدرجة عالية للعزلة المصرية من الفيروس حيث كانت نسبة النباتات الخالية من الأعراض حتى الأسبوع السادس من الحقن 66.7، 88.9 & 83.3 % علي التوالي. كما ظلت الغالبية العظمي من هذه النباتات بدون أعراض حتى الأسبوع العاشر من الحقن.  وقد تم الحصول علي بذور هذه العائلات كمصدر للجيل الرابع. في القرعيات تم إنتاج نباتات كوسة معدلة وراثيا باستخدام استراتيجية الغلاف البروتيني ومقاومة لـ 2 و 3 فيروسات ومنها هجين F1 في أمريكا و آخر يحتوي علي جين الغلاف البروتيني لفيروسات موزيك الخيار وفيروس التبرقش الزوكيني الأصفر وفيروس موزيك البطيخ2 كما أوضح al. Tricoli et al., (1995). وفي الشمام انتج Yoshioka et al., (1993) & Fang and Grumet (1993) نباتات مقاومة لفيروسي موزيك الخيار وفيروس التبرقش الزوكيني الأصفر علي التوالي. وفي عام 1997 انتج Fuchs et al.,  نباتات كنتالوب مقاومة لفيروسات  موزيك الخيار وفيروس التبرقش الزوكيني الأصفر وفيروس موزيك البطيخ2 وتم تقييمها تحت ظروف الحقل لعامين.

          وفي هذه الدراسة تم إنتاج نباتات كوسة صنف اسكنداراني مقاومة لفيروس الـ ZYMV-Eg وذلك بإدخال جين الغلاف البروتيني لفيروس ZYMV-CT . وقد تم الحصول علي ثمار وبذور جيدة الجودة في ثلاثة أجيال كما في أشكال (9، 10،11). وهذا العمل هو الأول في مصر حيث تم تقيم ثلاثة أجيال لنباتات كوسة معدلة وراثيا تحت ظروف الصوب البلاستيكية.

 

 

 

 

جدول رقم (4): تقببم الفيروس لنباتات الكوسة المعدلة وراثيا (R2) والمحتوية علي جين الغلاف البروتيني للعزلة الفيروسية الـ ZYMV-CT  بعد 2، 4 & 6 أسابيع من الحقن مرتين بالعزلة المصرية بناء علي الأليزا والأعراض.

 

 

الخطوط المعدلة وراثيا

الأسابيع بعد الحقن بالفيروس

2

4

6

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

5FA

0*

100

11.1

88.9

22.2

77.8

5FB

0

100

22.2

77.8

33.3

66.7

5FC

0

100

22.2

77.8

33.3

66.7

5FD

0

100

11.1

88.9

22.2

77.8

17FE

0

100

33.3

66.7

44.4

55.6

17FG

0

100

22.2

77.8

33.3

66.7

17FH

0

100

11.1

88.9

22.2

77.8

مقارنة

74

0

100

0

100

0

+: موجب.       -: سالب.                  س: أعراض.              أ: أليزا.           *: % النباتات .

 

 

 


 


جدول رقم (5): تقببم الفيروس لنباتات الكوسة المعدلة وراثيا (R3) والمحتوية علي جين الغلاف البروتيني للعزلة الفيروسية الـ ZYMV-CT  بعد 2، 4 & 6 أسابيع من الحقن مرتين بالعزلة المصرية بناء علي الأليزا والأعراض.

 

 

الخطوط المعدلة وراثيا

الأسابيع بعد الحقن بالفيروس

2

4

6

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

س+&أ+

س-&أ+

5FA1

0*

100

22.2

77.8

44.4

55.6

5FA2

0

100

27.8

722

38.9

61.1

5FB1

0

100

16.7

83.3

417

58.3

5FD1

0

100

33.3

66.7

44.4

55.6

17FH1

0

100

13.3

86.7

33.3

66.7

17FH2

0

100

0

100

11.1

889

17FH3

0

100

5.6

94.4

16.7

83.3

17FE1

0

100

33.3

66.7

44.4

55.6

مقارنة

83.3

16.7

100

0

100

0

+: موجب.       -: سالب.                  س: أعراض.              أ: أليزا.           *: % النباتات .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


المراجع

Abdel-Ghaffar, M.H., El-Dougdoug, K.A. and Sadik, A.S. (1998). Serology and characterization of the Egyptian isolate of zucchini yellow mosaic potyvirus. Arab Univ. J. Agric. Sci., Ain Shams Univ., Cairo 6(2):3-327.

 

Abou-Salha, A., Khalil, S., Badawi, M. and El-Sayed, S. (1996). Genetic engineering of Egyptian squash for resistance to zucchini yellow mosaic virus. Egypt. J. Genet. Cytol., 25:101-112.

 

Carr, J.P., Gal, On.A., Palukaitis, P. and Zaitin, M. (1994). Replicase-mediated resistance to cucumber mosaic virus in transgenic plants involves suppression of both virus replication in the inoculated leaves and long-distance movement. Virology 199: 439-447.

 

Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses.  J. Gen. Virol., 34:475-483.

 

Clough, G.H. and Hamm, P.B. (1995). Coat protein transgenic resistance to watermelon mosaic and zucchini yellows mosaic virus in squash and cantaloupe. Plant Dis. 79:1107-1109.

 

Dong, J.Z., Yang, M.Z., Jia, S.R. and Chua, N.H. (1991). Transformation of melon (Cucumis melon L.) and expression from the Cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic melon plant. Bio/Technology 9: 858-863.

 

Fang, G. and Grumet, R. (1990). Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and regeneration of muskmelon plants. Plant Cell Reports 9: 160-164.

 

Fang, G. and Grumet, R. (1993). Genetic engineering of potyvirus resistance using constructs derived from the zucchini yellow mosaic virus coat protein gene. Mol. Plant Microbiol. Interact. 6: 358-367.

 

Fuchs, M., Mcferson, R.J., Tricoli, M.D., McMastr, T.J., Deng, R.Z., Boeshore, M.L., Reynolds, J.F., Russell, P.F., Quemada, H.D. and Gonsalves, D. (1997). Cantaloupe line CZW-30 containing coat protein genes of cucumber mosaic virus, zucchini yellow mosaic virus, watermelon mosaic virus-2 is resistant to those three viruses in the field. Molecular Breeding 3: 279-290.

 

Gonsalves D. and Silghtom, J.L. (1993). Coat protein-mediated protection: analysis transgenic plants for resistance in a variety of crops. Sem Virol. 4: 397-405.

 

Harding, R.M., Burns, T.M. and Dale, J.L. (1991). Virus-like particles associated with banana bunchy top disease contain small single-stranded DNA. J. Gen. Virol., 72: 725-730.

 

Lomonoscoff, G.P. (1995). Pathogen-derived resistance to plant viruses. Ann. Rev. Phytopathol. 33: 323-343.

 

Manger, M.H. (1993). Breeding for Viral Resistance in Cucurbit. In : Resistance to Viral Diseases of Vegetables: Genetics and Breeding (Kyle M.M., ed): 8-43. Timber Press. Protland. OR.

 

Namba, S., Ling, K., Gonsalves, C., Slightom, J.L. and Gonsalves, D. (1992). Protection of transgenic plants expressing the coat protein gene of watermelon mosaic virus 2 or zucchini yellow mosaic virus against six potyviruses. Phytopathology 82 : 940-946.

 

Othman, B.A., El-Dougdoug, K.A., Sadik, A.S. and Abdul-Ghaffar, M.H. (1996). Detection of banana bunchy top virus in some banana plantations in Kalubia governorate. Ann. Agric. Sci., Ain Shams Univ., Cairo Egypt 41:627-634.

 

Powell-Abel, P., Nelson, R.S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S. G., Farley, R. T. and Beachy, R.N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat-protein.  Gene Sci. 232:738-743.

 

Provvidenti, G., Manger, H.M. and Paulus, A.O. (1984). Epidemics of zucchini yellow mosaic virus and other cucurbit viruses in Egypt in the spring 1983. Cucurbit Genet. Crop 7:78-79.

 

Sadik, A.S.  (1994). Studies on viruses affecting banana in Egypt. Ph.D., Thesis, In Agricultural Virology, Depart. Agric. Microbiol., Faculty of Agric., Ain Shams Univ., Cairo, Egypt, pp. 42-48.

 

Sadik, A.S., Abdel-Ghaffar, M.H., Salama, M.I. and Allam, E.K. (1997).  Evaluation of three different methods for detection of banana bunchy top nanavirus. Proceedings of The 9th Conference of Microbiology, Cairo, March 25-27, 188-202.

 

Sherf, A.F. and MacNab, A.A. (1986). Cucurbits. In: Vegetable Diseases and Their control (Johy Wiley & Sons, 2nd ed.): 353-379 New York.

 

Shukla, D.D.; Ward, C.W. and Brunt, A.A. (1994). The Potyviridae Cambridge University Press, Cambridge.

 

Tricoli, D.M., Carney, K.J., Russell, P.F., McMaster, J.R., Groff, D.W., Hadden, K.C., Himmel, P.T., Bubbard, J.P., Boeshore, M.L., Reynolds, J.F. and Quemada, H.D. (1995). Field evaluation of transgenic squash containing single or multiple virus coat protein gene constructs for resistance to cucumber mosaic virus, watermelon mosaic virus 2, and/or zucchini yellow mosaic virus. Bio/Technology 13: 1458-1465.

 

Wang, H.L., Gonsalves, G., Provvidenti, R. and Zitter, T.A. (1992). Comparative biological and serological properties of four strains of zucchini yellow mosaic virus. Plant Dis., 76: 530-535.

 

Webb, S.E. and Linda, S.B. (1993). Effect of oil and insecticide on epidemics of potyvirus in watermelon in Florida. Plant Dis. 77:864-869.

 

Yoshioka, K., Hanada, K., Nakazaki, Y., Minobe, Y. and Oosawa, K. (1993). Virus resistance in transgenic melon plants that express the cucumber mosaic virus coat protein gene in their progeny. Jpn. J. Breed., 43: 629-634.

 

Zitter, T., Hopkins, D.L. and Thomas, C.E. (1996). Diseases caused by viruses. In: Compendium of Cucurbit Diseases, pp. 37-45. APS Press. St. Paul.

 


*  معهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية- مركز البحوث الزراعية.

** كلية الزراعة-جامعة عين شمس.

*** معهد بحوث البساتين- مركز البحوث الزراعية.